方案概述
前言：
機(jī)動(dòng)車駕駛?cè)搜褐芯凭磕軌蛑庇^地反映駕駛?cè)藛T在駕駛車輛時(shí)駕駛能力的受損程度，檢測(cè)結(jié)果作為是否酒駕和醉駕的判斷依據(jù)，法庭辯護(hù)中需要使用乙醇濃度的定量值，因此血醇濃度測(cè)定成為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室最常進(jìn)行的項(xiàng)目。頂空氣相色譜測(cè)定醉酒駕駛?cè)藛T血液中的乙醇含量是最常見和最普遍的一個(gè)應(yīng)用方法。
本文參考《GB/T 42430-2023血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇和正丁醇檢驗(yàn)》，使用皖儀科技?xì)庀嗌V儀GC6100以及全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器HS-15，采用雙柱系統(tǒng)雙FID檢測(cè)器分析方法對(duì)血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇和正丁醇檢驗(yàn)進(jìn)行分析，線性、檢出限、定量限、定量重復(fù)性、相對(duì)相差均符合相關(guān)要求，且所有化合物在較短時(shí)間內(nèi)完成分離，能快速準(zhǔn)確檢測(cè)人血液、尿液中的醇類，丙酮等化合物。
關(guān)鍵詞：氣相色譜、頂空進(jìn)樣器、雙柱系統(tǒng)雙FID檢測(cè)器、乙醇。
1.儀器設(shè)備及試劑
1.1 儀器配置清單
表1 儀器配置清單表
序號(hào) | 名稱 | 數(shù)量 |
1 | GC6100氣相色譜儀 | 1臺(tái) |
2 | 分流/不分流進(jìn)樣口 | 1套 |
3 | FID檢測(cè)器 | 2套 |
4 | HS-20全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器（10mL頂空瓶） | 1臺(tái) |
5 | BAC1 (30m×0.32mm×1.8μm)柱或等效色譜柱； | 1根 |
6 | BAC2 (30m×0.32mm×1.2μm)柱或等效色譜柱； | 1根 |
7 | SmartLab CDS 2.0色譜工作站 | 1套 |
1.2 試劑及標(biāo)準(zhǔn)品清單
表2 試劑及標(biāo)品清單表
序列 | 試劑及標(biāo)準(zhǔn)品 | 純度 |
1 | 甲醇 | 色譜純99.9% |
2 | 乙醇 | 色譜純99.9% |
3 | 丙酮 | 色譜純99% |
4 | 正丙醇 | 色譜純99.9% |
5 | 異丙醇 | 色譜純99.9% |
6 | 叔丁醇 | 色譜純99.9% |
7 | 正丁醇 | 色譜純99.9% |
1.3 實(shí)驗(yàn)材料及輔助設(shè)備
1.3.1萬分之一天平
1.3.2 氫氣發(fā)生器
1.3.3空氣發(fā)生器
2.實(shí)驗(yàn)方法
2.1 溶液配置
2.1.1 10mg/mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液
準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)乙醇（甲醇、乙醛、丙酮、正丙醇、異丙醇、正丁醇）適量，用水配置成10.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。
2.1.5 5mg/mL內(nèi)標(biāo)物叔丁醇標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液
準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)叔丁醇適量，用水配置成5.0mg/mL標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)儲(chǔ)備液。
2.2 實(shí)驗(yàn)條件
2.2.1氣相色譜條件
柱1：BAC1毛細(xì)管柱 30m×0.32mm×1.8μm
柱2：BAC2毛細(xì)管柱 30m×0.32mm×1.2μm
進(jìn)樣口溫度：150℃ 柱流量：4mL/min 分流比：10：1
柱溫：40℃（5min），20℃/min升至100℃
檢測(cè)器： 溫度：250℃ 氫氣：30mL/min 空氣：300mL/min 尾吹(N2)：10mL/min
2.2.2頂空進(jìn)樣器條件
加熱爐溫度：65℃
定量環(huán)溫度：105℃
傳輸線溫度：110℃
加熱平衡：10min
GC分析：8min
進(jìn)樣：1min
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
3.1標(biāo)準(zhǔn)品譜圖
圖1 空白色譜圖
圖2 目標(biāo)化合物在BAC1柱出峰圖（1mg/mL）
表3 目標(biāo)化合物在BAC1柱上色譜參數(shù)表
序號(hào) | 化合物名 | 保留時(shí)間(min) | 峰面積(pA*s) | 理論塔板數(shù) | 分離度 |
1 | 甲醇 | 1.439 | 23.609 | 11942 | 7.141 |
2 | 乙醇 | 1.821 | 50.021 | 17983 | 4.168 |
3 | 丙酮 | 2.051 | 184.89 | 21536 | 2.091 |
4 | 異丙醇 | 2.174 | 97.51 | 19827 | 4.702 |
5 | 叔丁醇 | 2.496 | 40.806 | 17620 | 8.806 |
6 | 正丙醇 | 3.181 | 96.602 | 25062 | 29.015 |
7 | 正丁醇 | 6.783 | 145.246 | 26098 | n.a. |
圖3 目標(biāo)化合物在BAC2柱出峰圖（1mg/mL）
表4 目標(biāo)化合物在BAC2柱上色譜參數(shù)表
序號(hào) | 化合物名 | 保留時(shí)間(min) | 峰面積(pA*s) | 理論塔板數(shù) | 分離度 |
1 | 甲醇 | 1.34 | 40.429 | 12400 | 6.015 |
2 | 乙醇 | 1.663 | 86.469 | 12598 | 5.023 |
3 | 異丙醇 | 2.01 | 156.399 | 10412 | 3.976 |
4 | 叔丁醇 | 2.386 | 68.483 | 7459 | 2.434 |
5 | 正丙醇 | 2.636 | 161.039 | 12273 | 2.968 |
6 | 丙酮 | 2.927 | 297.901 | 13470 | 15.569 |
7 | 正丁醇 | 5.084 | 242.323 | 13331 | n.a. |
說明：由上述譜圖可見，空白樣品在兩個(gè)檢測(cè)器FID 1、FID2上均未出現(xiàn)目標(biāo)物乙醇（甲醇、丙酮、正丙醇、異丙醇、正丁醇）色譜峰，各物質(zhì)間色譜峰的分離度均大于1.5，滿足實(shí)驗(yàn)分析需求。
3.2校準(zhǔn)曲線
3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液配置
用水將10.0mg/mL乙醇（甲醇、丙酮、正丙醇、異丙醇、正丁醇）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液標(biāo)，逐級(jí)稀釋成0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、3.0mg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。
用水將5.0mg/mL叔丁醇配置0.04mg/mL叔丁醇內(nèi)標(biāo)工作液。
取標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 及 0.04 mg/mL 內(nèi)標(biāo)物叔丁醇工作溶液 500 μL（采用外標(biāo)法時(shí)，以水替代內(nèi)標(biāo)物叔丁醇工作溶液）置于頂空進(jìn)樣瓶?jī)?nèi)，蓋緊硅橡膠墊，混勻，置于頂空自動(dòng)進(jìn)樣器樣品盤上進(jìn)樣。
3.2.2 外標(biāo)-曲線法
前通道FID1
表5 目標(biāo)化合物在FID1校準(zhǔn)曲線和線性范圍
甲醇 R=0.99959  | 乙醇 R=0.99976  |
丙酮 R=0.99993  | 異丙醇 R=0.99989  |
正丙醇 R=0.99985  | 正丁醇 R=0.99989  |
后通道FID2
表6 目標(biāo)化合物在FID2校準(zhǔn)曲線和線性范圍
甲醇 R= 0.99984  | 乙醇 R=0.99984  |
異丙醇 R=0.99979  | 正丙醇 R=0.99969  |
丙酮 R=0.99993  | 正丁醇 R=0.99986  |
3.2.2 內(nèi)標(biāo)-曲線法
前通道FID1
甲醇 R=0.99999  | 乙醇 R=0.99999  |
丙酮 R=0.99999  | 異丙醇 R=0.99997  |
正丙醇 R=0.99998  | 正丁醇 R=0.99997  |
表7目標(biāo)化合物在FID1校準(zhǔn)曲線和線性范圍
后通道FID2
表8目標(biāo)化合物在FID1校準(zhǔn)曲線和線性范圍
甲醇 R= 0.99987  | 乙醇 R=0.99986  |
異丙醇 R=0.99982  | 正丙醇 R=0.99983  |
丙酮 R=0.99992  | 正丁醇 R=0.99980  |
由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知乙醇（甲醇、丙酮、正丙醇、異丙醇、正丁醇）標(biāo)準(zhǔn)溶液中各組分的線性良好，線性相關(guān)系數(shù)R＞0.999，滿足實(shí)驗(yàn)分析需求。
3.3定量重復(fù)性
3.3.1外標(biāo)-曲線法
取濃度為1mg/mL的水中標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 及 500 μL水，用頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)試6次，計(jì)算重復(fù)性。
圖4 1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定量重復(fù)性圖
表9 化合物定量重復(fù)性（外標(biāo)法）
化合物 | FID1 | FID2 |
面積重復(fù)性 | 面積重復(fù)性 | |
甲醇 | 1.713% | 1.703% |
乙醇 | 1.786% | 1.740% |
丙酮 | 1.531% | 1.525% |
異丙醇 | 1.765% | 1.750% |
正丙醇 | 1.731% | 1.718% |
正丁醇 | 1.805% | 1.583% |
3.3.2內(nèi)標(biāo)-曲線法
取濃度為1mg/mL的水中標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 及0.04 mg/mL 內(nèi)標(biāo)物叔丁醇工作溶液 500 μL，用頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，重復(fù)測(cè)試6次，計(jì)算重復(fù)性。
圖5 1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液定量重復(fù)性圖（內(nèi)標(biāo)法）
表9 化合物定量重復(fù)性（內(nèi)標(biāo)法）
化合物 | FID1 | FID2 |
面積重復(fù)性 | 面積重復(fù)性 | |
甲醇 | 0.820% | 1.224% |
乙醇 | 0.878% | 1.091% |
丙酮 | 0.868% | 0.879% |
異丙醇 | 0.852% | 0.865% |
正丙醇 | 0.841% | 0.921% |
正丁醇 | 0.768% | 0.766% |
3.4檢出限
取濃度為0.05mg/mL的水中標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 及水500 μL，置于頂空瓶，用頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，采集完成后，從色譜圖中識(shí)別，讀取目標(biāo)化合物峰高和基線噪音計(jì)算信噪比（S/N）。
圖6 0.05mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
表10 0.05mg/mL各化合物信噪比
序號(hào) | 化合物名 | 保留時(shí)間(min) | 峰面積(pA*s) | 峰高(pA) | 樣品量 | 信噪比 |
1 | 甲醇 | 1.444 | 1.268 | 0.502 | 0.055mg/L | 116.870 |
2 | 乙醇 | 1.837 | 2.649 | 0.909 | 0.058mg/L | 211.532 |
3 | 丙酮 | 2.057 | 11.373 | 4.573 | 0.059mg/L | 1064.229 |
4 | 異丙醇 | 2.184 | 5.331 | 1.827 | 0.057mg/L | 425.139 |
5 | 正丙醇 | 3.199 | 5.358 | 1.453 | 0.058mg/L | 338.023 |
6 | 正丁醇 | 6.814 | 7.611 | 1.108 | 0.057mg/L | 257.840 |
標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定方法檢測(cè)限為 0.05mg/mL，本方法中各化合物在濃度為0.05mg/mL信噪比遠(yuǎn)大于3，符合國(guó)標(biāo)要求。
3.5定量限
取濃度為0.1mg/mL的水中標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 及水500 μL，置于頂空瓶，用頂空進(jìn)樣器進(jìn)樣，采集完成后，從色譜圖中識(shí)別，讀取目標(biāo)化合物峰高和基線噪音計(jì)算信噪比（S/N）。
圖7 0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
表11 0.1mg/mL各化合物信噪比
序號(hào) | 化合物名 | 保留時(shí)間(min) | 峰面積(pA*s) | 峰高(pA) | 樣品量 | 信噪比 |
1 | 甲醇 | 1.444 | 2.752 | 1.079 | 0.108mg/L | 294.926 |
2 | 乙醇 | 1.833 | 5.671 | 2.034 | 0.108mg/L | 555.923 |
3 | 丙酮 | 2.054 | 21.791 | 9.181 | 0.105mg/L | 2508.968 |
4 | 異丙醇 | 2.181 | 10.990 | 3.929 | 0.107mg/L | 1073.720 |
5 | 正丙醇 | 3.193 | 11.336 | 3.182 | 0.107mg/L | 869.740 |
6 | 正丁醇 | 6.801 | 16.110 | 2.414 | 0.106mg/L | 659.754 |
標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定方定量限為 0.1mg/mL，本方法中各化合物在濃度為0.1mg/mL信噪比遠(yuǎn)大于10，符合國(guó)標(biāo)要求。
3.6相對(duì)相差
取濃度為 0.1mg/1mL的水中標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL 及0.04 mg/mL 內(nèi)標(biāo)物叔丁醇工作溶液 500 μL，配置2份，用頂空自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)樣。記錄 2 份樣品中各組分在FID1和FID2上的濃度，計(jì)算各組分含量的相對(duì)相差。
圖8 兩份0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖
表11 0.1mg/mL各化合物相對(duì)相差
序號(hào) | 化合物名 | FID1 | |||
樣品量1（mg/mL） | 樣品量2（mg/mL） | 平均值（mg/mL） | 相對(duì)相差 | ||
1 | 甲醇 | 0.111 | 0.111 | 0.111 | 0 |
2 | 乙醇 | 0.114 | 0.113 | 0.1135 | 0.8% |
3 | 丙酮 | 0.110 | 0.110 | 0.110 | 0 |
4 | 異丙醇 | 0.104 | 0.106 | 0.105 | 1.9% |
5 | 正丙醇 | 0.111 | 0.111 | 0.111 | 0 |
6 | 正丁醇 | 0.106 | 0.107 | 0.1065 | 0.9% |
序號(hào) | 化合物名 | FID2 | |||
樣品量1（mg/mL） | 樣品量2（mg/mL） | 平均值（mg/mL） | 相對(duì)相差 | ||
1 | 甲醇 | 0.115 | 0.111 | 0.113 | 3.5% |
2 | 乙醇 | 0.113 | 0.114 | 0.1135 | 0.88% |
3 | 丙酮 | 0.109 | 0.111 | 0.110 | 1.8% |
4 | 異丙醇 | 0.104 | 0.107 | 0.1055 | 2.8% |
5 | 正丙醇 | 0.111 | 0.112 | 0.1115 | 0.9% |
6 | 正丁醇 | 0.108 | 0.107 | 0.1075 | 0.9% |
4.結(jié)論
本方法使用皖儀科技GC6100氣相色譜儀以及全自動(dòng)頂空進(jìn)樣器HS-20，采用雙柱系統(tǒng)雙FID檢測(cè)器分析方法對(duì)血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇和正丁醇檢驗(yàn)進(jìn)行分析。由數(shù)據(jù)可得該方法的各色譜峰峰形良好、分離度符合國(guó)標(biāo)要求，線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999，符合國(guó)標(biāo)規(guī)定的線性相關(guān)系數(shù) r 不小于 0.997要求，定量重復(fù)性小于2%，含量相對(duì)相差小于4%，優(yōu)于國(guó)標(biāo)要求，檢出限、定量限均滿足要求，說明了該方法配備皖儀科技?xì)庀嗌V雙柱雙檢測(cè)器系統(tǒng)滿足對(duì)待測(cè)樣本的常規(guī)性定性定量檢測(cè)需求。
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